Ce second opus introduit le personnage Ezio Auditore da Firenze, qui se verra consacré trois jeux, avec Assassin's CreedBrotherhood et Revelations.
Se basant toujours sur des mécaniques de jeu alliant action, aventure et infiltration, le joueur est transposé dans l'univers du héros. Ce dernier peut se balader autour de nombreux bâtiments, comme la chapelle Sixtine ou encore visiter la Toscane, Venise ou Forli.
L'équipe Ubisoft en charge de la modélisation des décors s'est particulièrement appliquée à la réalisation de ceux-ci, incluant de nombreux détails, permettant l'immersion complète du joueur.